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检验检疫 | 政策法规 | 进口国官方 | 德国 | 服装 | 2012-09-19 |
详细内容参见如下网址:
欧洲 EN1884-1998“ 羽毛和羽绒试验方法微生物状态的测定”
http://esearch.cen.eu/esearch/Details.aspx?id=6846141
相关欧盟各国测定方法
http://esearch.cen.eu/esearch/CatWeb.aspx?id=6846141
1 浸渍玻璃片法
此方法的程序是使用两种类型的琼脂检测是否存在共生细菌和大肠杆菌 (革兰氏阴性),适合生产者用简单的方法了解羽绒制品填充物的卫生状况。此种方法不能检测还原的亚硫酸盐的梭状芽胞杆菌 (革兰氏阳性)和沙门氏菌(革兰氏阴性)。
其原理是将19 mm X 50 mm麦康凯琼J][~/CLED培养基浸渍玻璃片[CLED(胱氨酸、乳糖、电解质)和Mac.Conkey麦康凯】放在灭菌的圆柱形容器里,用最初提取液浸没,(37?I)oc培养过夜。对不同类型琼脂平板上生长的菌落计数,表明了微生物污染的程度。CLED培养是选择性培养基,主要用于尿液和粪便中致病菌的培养。麦康凯琼脂适合大肠菌群的生长。
2.2 选择性培养基和平板计数法
24 中田纤捡 8008年第6期无锡出入境检验检疫局 邓瑾 杨顺兴 扬州出入境检验检疫局 朱虹葛勇此种方法的程序是使用不同类型的培养基证实存在的细菌种类和数量:嗜温性需氧菌、粪链球菌、还原亚硫酸盐的梭状芽胞杆菌和沙门氏菌。此种方法常常用于未经加工的原料和羽绒制品,相对浸渍玻璃片法而言,在控制填充物的微生物状况方面可以提供更全面更特定的信息。
其原理是:通过混合两个测试样品的最初提取液而得到稀释液分为两部分:一部分进行十进制稀释,原液和稀释液选择三个稀释度,每个稀释度接种三种不同的选择性培养基,分别是测定嗜温性需氧菌、粪链球菌和还原亚硫酸盐的梭状芽胞杆菌。另一部分用醋酸纤维膜过滤,沙门氏菌不能通过滤膜。将滤膜接种到营养肉汤中,最后用部分肉汤接种沙门氏菌选择性培养
3 该标准采用的定义
该标准采用以下定义:
3.1 嗜温性需氧茵含量:微生物的定量,主要是指(30?2)oC有氧条件下生长的细茵含量。
3.2 粪链球茵:此种细茵属于乳酸杆茵科,主要是球茵(革兰氏阳性)。
3.3 还原亚硫酸盐的梭状芽胞杆茵,此种细茵属于梭状芽胞杆茵科,主要特性是杆状的(Jg兰氏阳性)、厌氧的和产芽胞的。
3.4 沙门氏茵:此种细茵属于肠杆茵科,主要特性是杆状的(Jg兰氏阴性)。
3.5 最初提取液:按照提供的条件用蛋白胨生理盐水处理样品后的滤液。
3.6 十进制稀释液:将最初提取液连续以十进制
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3.7 茵落形成单位 (cfu):在特定琼脂平板上由
单个细茵经过不断繁殖成为数百万个细茵而形成了茵
落。通过肉眼可以看到,由于琼脂平板的类型和培养条
件的不同,菌种具有不同的形态(豆状的、星状的等)和不同大小的茵落。
4 关于浸渍玻璃片法
4.1 设备器具
4.1,1 灭菌玻璃广口瓶,容量为 120 mL。
4.1.2 麦康凯琼脂/CLED培养基浸渍玻璃片,
19 Innl?50 millo
4.1,3 培养箱,温度能够维持在(37.4-1)℃。
4,1.4 灭菌防护手套(见EN 374—1和EN 374—
4.1.5 灭菌塑料袋。
4,1,6 感量为0.01 g的天平。
4.2 试剂:灭茵生理盐水,每升中含有 (8.5-t- O.2)g氯化钠。
4.3 步骤 4,3,1 采用无菌操作技术在已经调湿的实验室散装样品(见EN 1883)中取出5份1.0 g样品,最大误差不超过0.05g。
4.3.2 将样品放入容量为 120 mL的灭菌玻璃广口瓶中,瓶中加入100 mL灭菌生理盐水。盖好盖子用手用力振荡(60?2)s。 数(efu)表示。
4.3.9 结果报告:报告5个样品结果的平均值和标准偏差。
5 选择性培养基和平板计数方法
5.1 设备 5,1.1 温度为(121?1)qC的高压灭菌器。
5,1.2 温度在 170%1~175℃之间用于玻璃器具灭菌的干烤箱。
5.1.3 用于混合稀释液的试管振荡器。
5.1.4 温度控制误差不超过 ?1cI=的恒温箱。
5,1.5 温度控制误差不超过?1℃的水浴锅。
5,1.6 菌落计数设备:包括与黑暗背景相配的光源,放大1,5倍的放大镜和一个机械式或数字式的菌落计数器。 5,1.7 pH计。
5.1.8 感量为0,01 g的天平。
5,1.9 带有密封塞子的2 000 mL的玻璃广口三角烧瓶。
5.1.10 带有密封塞子的玻璃试管,容量为 10mL和 1 mL。
5.1.11 10 mL和1 mL的移液管。
5.1.12 直径为90 Innl~100 mill的玻璃或塑料培养皿。
5.1.13 消毒防护手套(见EN 374—1和EN 374—
4.3.3 将浸渍玻璃片从灭菌容器中取出,立即 2)。 垂直浸渍在振荡过的生理盐水中。
4.3.4 取出浸渍玻璃片,沥水数秒后,将它放入灭菌的容器中,温度(37?1)℃,培养(16?2)h。
4.3.5 对其余 4份测试样品重复 4.3.2至4.3,4的步骤。
4.3.6 和测试样品一样,将浸渍玻璃片浸入直接灭菌生理水中进行无菌对照试验,只有当无菌对照的浸渍玻璃片上无细菌生长时,此试验才能有效。
4.3.7 培养结束后,取出每个样品浸渍玻璃片,对两种类型的琼脂上的菌落形成单位(cfu)进行计数。如果琼脂上长满了细菌以至于看不到单个菌落,或者菌落互相之间结合在一起很难准确地计数时,结果记录为“多不可计”(TMTC)。偶尔长在浸渍玻璃片的边缘的细菌不像生长在浸渍玻璃片中央的那样形成正常的圆形菌落,但是有时
沿着浸渍玻璃片边缘蔓延了几厘米,这种情况应作为一 个菌落。
4.3.8 结果的表示:结果以某一稀释度的菌落
5.1.14 5.1.15 5.1.16 5.1.17 5.1-18 消毒塑料袋。 消毒纱布。 孔径为0.45 Izm 的醋酸纤维素膜。 机械振荡器。
5.1.19 玻璃珠。
5.2 试剂 5.2.1 蒸馏水 (符合 EN ISO 3696{分析实验室用水——使用说明及测试方法》标准的三级水)或等同质量的水,即在试验条件下没有抑制或影响微生物生
长的物质。如果蒸馏水是用有氯的水制备的,在蒸馏前要将氯除掉。
5.2.2 0.1%蛋白胨生理盐水
成分:蛋白胨 1 g
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1 000 mL
配制:将培养基溶解在1 L的蒸馏水中,调pH值使其灭菌后25%1为7.0。用高压消毒器(121 4-1)℃消中毒 15 min。
5.2.3 平板计数的标准琼脂培养基
成分:酵母浸膏 2.5 g
胰蛋白胨 5 g
葡萄糖 1 g 琼脂粉 15 g
将以上成分加入 1 L蒸馏水中,加热煮沸直到完全溶解,放人三角烧瓶,然后在(121-I-1)oC高压消毒器中消毒15min。
5.2.4 EDWARDS培养基
成分:牛肉浸膏 10 g
蛋白胨 10 g
七叶甙 1 g 氯化钠 5 g
结晶紫 0.001 3 g
硫酸铊 0.33 g
琼脂 15 g 配制:将以上成分加到1 L蒸馏水中,加热煮沸直到完全溶解,冷却至50℃,加入5%一7%无菌牛血或绵羊血,充分混合,倾注平板。
5.2.5 用于肠球菌的Slanetz和Bartley培养基
成分:胰蛋白胨 20 g
酵母浸膏 5 g
葡萄糖 2 g 二水含磷酸氢二钠 4 g
叠氮钠 0.4 g
氯化四氮唑 0.1 g
琼脂 10 g 配制:将以上成分加入 1 L蒸馏水中,加热煮沸直到完全溶解,避免加热过长,倾注培养皿,直至凝固。
5.2.6 米勒一霍夫曼法的四硫酸盐肉汤
成分:胰蛋白胨 7 g
大豆蛋白胨 2.3 g
氯化钠 2.3 g
碳酸钙 25 g
硫代硫酸钠 40.7 g
牛胆汁 4.75 g
配制:将以上各成分加入1 L蒸馏水中,加热煮沸,冷却至45~C以下,在使用前加入19 mL的碘液(5.2.7)和9.5 mL的0.1%煌绿溶液(5.2.8),混合均为中)a~lit 20O3年囊e疆匀,倒入灭菌试管或三角烧瓶中。
5.2.7 碘液
成分:碘 20 g
碘化钾 25 g
加入蒸馏水至 100 mL
配制:用大约5 mL的蒸馏水碘化锂,加入碘,搅拌直至完全溶解。用蒸馏水定容至100 mL。
5.2.8 煌绿溶液
成分:煌绿 0.1 g
蒸馏水 100 mL
配制:将煌绿加于蒸馏水内,加热溶解,不时地搅拌直至完全溶解。装入棕色试剂瓶避光保存。
5.2.9 煌绿琼脂培养基
成分:月示蛋白胨 10 g
酵母浸膏 3 g
氯化钠 5 g 乳糖 10 g
蔗糖 10 g 酚红 0.08 g
煌绿 0.012 5 g
琼脂 12 g 配制:将以上成分溶于1 L蒸馏水中,煮沸直至完全溶解,(121-I-1)℃高压灭菌15 min。
5.2.10 亚硫酸铁多粘菌素B琼脂培养基
成分:胰蛋白胨 15 g
酵母浸膏 10 g
枸橼酸铁 0.5 g
亚硫酸钠 1 g
琼脂 16 g 配制:将以上成分溶于 1 L蒸馏水中,使用时熔化
100 mL的培养基,冷却至50~C,加入0.2 mL的0.001%硫酸多粘菌素B水溶液和0.5 mL的0.01%硫
酸新霉素水溶液,用塞氏器过滤除菌。
注意:在准备使用前配制。
5.3 步骤 5.3.1 使用手套 (见EN 374—1和EN 374—2) 和无菌操作技术从已调湿的散装样品中取12 g左右的两个测试样品,精确至0.1 g。
5.3.2 将每个测试样品放到带玻璃珠的玻璃瓶中,不要丢失样品,加入0.1%的蛋白胨生理盐水1 200mL,机械振荡3 h。
5.3.3 用消毒纱布过滤,在无菌条件下混合两个测试样品的最初提取液。
5.3.4 取2 mL最初提取液 (5.3.3),用灭菌试管十进制稀释至少 lO个稀释度。
5.4 嗜温性需氧茵含量
5.4.1 未稀释的最初的稀释液和每个稀释度分别需要3个培养皿。在每个培养皿中分别加入已熔化的标准平板计数培养基 25 mL。在琼脂还是熔化状态时,接种 1 mL未稀释的最初提取液和各个稀释度的稀释液,在琼脂凝固之前混匀。(30?2)℃培养48 h~725.4.2 每个不同稀释度生长的菌落进行计数,用常规的统计学方法计算每个样品中细菌的平均数。
5.5 粪链球茵数
5.5.1 菌落数在 1000 cfu以上的8.未稀释的最初稀释液 (5.3.3)和每个稀释度的稀释液接种0.1 mL到 Edwards培养基 (5.2.4) 或Slanetz和Bardey培养基平板上,使溶液分散在平板表面上。每个稀释度接种3个平板。(30?2)℃培养 24h~48 h。
b.对黑色和红棕色的点状菌落计数。
c.用显微镜检验它们是否属于链球菌群。
d.属于兰斯菲尔德D群的进行血清学和生化试
5.5.2 菌落数在 100 cfu以上的
8.用醋酸纤维素膜过滤 100 mL的最初稀释液和十进制稀释液。
b.将膜放在已倾注Slanetz和Barfley培养基,并已凝固的培养皿中,每个稀释度3个培养皿。
c.(30?2)℃培养 24 h~48 h。
d.对红棕色的点状菌落计数。
5.6 还原亚硫酸盐的梭状芽胞杆茵的计数
5.6.1 (75?2)℃水浴加热最初稀释液和十进制稀释液 10 min,分别接种 1 mL到亚硫酸铁多粘菌素B琼脂培养基,(37?2)℃厌氧条件下培养48 h。
5.6.2 用高层培养技术,将接种物放人大试管中,每个稀释度3管或者在已接种的培养基上加入5mL同样的培养基覆盖在其表面。
5.6.3 对不同稀释度的菌落进行计数,用常规统计学方法计算每克样品的平均菌落数。
5.7 沙门氏茵的检验
5.7.1 用醋酸纤维素膜过滤2 000 mL最初稀释液,用灭菌蒸馏水洗涤,接种到 100 mL的Milller— Kauffmann肉汤中o
5.7.2 (45?2)℃水浴15 min,然后在(43?2)℃ 培养 15 h~18 h。
5.7.3 取一铂耳肉汤培养基接种在煌绿琼脂培养基上,(37?2)℃培养24 h。
5.7.4 无色、半透明周围明显变红的菌落为可疑
5.7.5 通过生化和血清学试验对可疑菌落进行
5.8 结果的表述
平板菌落数在30 cfu~300 cfu之间的为合适范围,具有统计学意义。如果菌落数小于100,四舍五人为5的倍数;如果菌落数大于100,四舍五入为1O的倍
将此数值乘以相对应的稀释度就得到每克产品中的菌落形成单位(cfu/g)。
采用1~9.9乘以lO一来表示结果,n表示lO的指6 检测报告 检测报告至少包括以下信息:
—— 相关的测试标准
测试的日期和地点
—— 测试样品的标记
测试产品的cfu/g。嗜温性需氧菌;粪链球菌;
还原亚硫酸盐的梭状芽胞杆菌;20 g产品沙门氏菌未
检出(检出)。
任何不符合标准的步骤和任何影响结果的情
中田纤 2OO3年一6一刀